常見細菌染色方法

       常見的染色方法包括簡單染色、負染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色。制備細菌染色片一般要經過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟，然后用顯微鏡甚至油鏡觀察。

1. 簡單染色：

      不同細菌或由于觀察者所側重觀察的內容不同，所使用的染料也有差異，但簡單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片，制成需要觀察的玻片后，使用相對應的染料滴加到玻片上的菌膜區域，以覆蓋菌膜為準。按照不同染料的要求，結合所觀察的內容確定染色時間，染色時間到達時進行水洗，干燥等步驟。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進行鏡檢。如有需要可以后續再進行油封、蠟封等封片過程。

2. 負染色：

      制備觀察圖片是非常容易的，但對初學者來說想要在玻片中找到目標菌還是有一定難度的，因為細菌常常無色透明且較小，所以對初學者來說除非對光圈等進行很精細的調節，否則很難觀察到目標菌，因此進行負染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑混合，再將混合物覆蓋于載玻片表面，由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細胞，所以使得透明的微生物個體在黑色的背景下很容易觀察。

負染色法常見有兩種操作方法。

① 在一個載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合，用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄，在厚與薄中間的額區域就是最佳觀察區域。

② 用一接種環苯胺黑與微生物混合，用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區域。

3. 革蘭氏染色：

      革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。細菌先經堿性染料結晶紫染色，而后經碘液進行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染后的顏色不會脫去，有的可以被脫去，前者叫做革蘭氏陽性菌，后者為革蘭氏陰性菌。為方便進一步觀察，脫色后再用堿性蕃紅進行復染，陽性菌仍為紫色，陰性菌染成紅色，這就是革蘭氏染色的原理。

其步驟包括初染、媒染、脫色、復染四個步驟。

4. 芽孢染色法：

      部分細菌能產生內孢子，這些孢子能抵制細菌染色液的進入，在革蘭氏染色法涂片染色時，革蘭氏陽性菌的芽孢呈現無色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到，但在不易清晰觀察時，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現不同顏色，便于觀察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復紅染色法。

5. 鞭毛染色法：

      鞭毛是細菌的運動器官，非常纖細，超出了光學顯微鏡觀察極限，因此通常情況在顯微鏡下觀察不到。通過特殊的染色技術，可以將染色液附加到鞭毛的周圍，增加它的直徑，從而能在光學顯微鏡下觀察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復紅沉淀法兩種。

6. 莢膜染色：

      一般細菌的莢膜與染色劑的親和性低，但莢膜通透性高，因此染料可透過莢膜使菌體著色。一般采用負染色方法使背景和菌體之間形成一透明區，將菌體襯托出來便于觀察分辨。

莢膜染色步驟：加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端，無菌操作，挑取細菌斜面上培養72h左右的膠質芽孢桿菌與其混合，加1滴墨汁充分混勻，用推片法制片將菌液鋪成薄層，自然干燥，滴加1-2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%結晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸銅沖洗數次，再用自來水沖洗一次，使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。

染色法在細菌的觀察、分類、鑒定中經常用到，因此是微生物檢測人員不-可或缺的基本技能之一。

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